The Binding of Isaac tiene varios personajes jugables. Todos tienen estadísticas variadas u objetos iniciales diferentes; algunos poseen características únicas que obligan al jugador a manejarlos de formas distintas.

En el juego original había 4 personajes y 1 secreto. Después, en una actualización se añadió otro personaje, siendo 6 en total. Wrath of the Lamb añadió 1 personaje más, sumando 7 personajes en el juego original.

En The Binding of Isaac: Rebirth se incluyen estos 7 personajes y se añaden 4 más. The Binding of Isaac: Afterbirth introdujo un personaje más y uno secreto; The Binding of Isaac: Afterbirth+ también añadió sólo a un personaje, pero en una actualización se agregó otro personaje secreto.

Cada personaje tiene tres estadísticas básicas: la vida, el ataque y la velocidad (estas estadísticas estan indicadas detrás de cada uno de los personajes).

Isaac

Isaac

Magdalena

Magdalena

Cain

Cain

Judas

Judas

???

???

Eve

Eve

Samson

Samson

Azazel

Azazel

Lazarus

Lazarus

Eden

Eden

Lilith

Lilith