The Binding of Isaac tiene varios personajes jugables. Todos tienen estadísticas variadas u objetos iniciales diferentes; algunos poseen características únicas que obligan al jugador a manejarlos de formas distintas.

En el juego original había 4 personajes y 1 secreto. Después, en una actualización se añadió otro personaje, siendo 6 en total. Wrath of the Lamb añadió 1 personaje más, sumando 7 personajes en el juego original.

En The Binding of Isaac: Rebirth se incluyen estos 7 personajes y se añaden 4 más. The Binding of Isaac: Afterbirth introdujo un personaje más y uno secreto; The Binding of Isaac: Afterbirth+ también añadió sólo a un personaje, pero en una actualización se agregó otro personaje secreto.

Cada personaje tiene tres estadísticas básicas: la vida, el ataque y la velocidad (estas estadísticas estan indicadas detrás de cada uno de los personajes).

Isaac

Magdalena

Cain

Judas

???

Eve

Samson

Azazel

Lazarus

Eden

Lilith