Los monstruos son los mobs hostiles que actúan como los enemigos comunes durante todo el juego. Ellos aparecen en las habitaciones, siendo necesario matarlos para poder avanzar (o al menos de que se salte la habitación de otra forma). Cuanto más se esté avanzando, más difíciles los monstruos serán. Dependiendo del piso, hay conjuntos de monstruos específicos que están relacionados con la temática del mismo piso.
Los jefes son monstruos más poderosos que los comunes, y usualmente solo encontrados al final de cada piso. Sin embargo, en los pisos más difíciles es normal encontrar jefes como monstruos comunes.
Gran parte de estos monstruos son insectos, humanoides parecidos a Isaac, y demonios. Tienden a aparecer en grupos en cada habitación donde estén. También cabe desatacar que algunas trampas también son consideradas monstruos.
FrowningGaper
HP: 10
Monstruos que persiguen al jugador de forma lenta inicialmente, adquiriendo velocidad si están lo suficientemente cerca. Suelen ser encontrados en grupos, y tienen suficiente inteligencia para intentar tomar caminos cortos o intentar cortar el paso al jugador.
Gaper
HP: 10
Monstruos que siguen al jugador. A diferencia que los Frowning Gapers, los Gapers normales siempre caminan lento. Tienen la misma inteligencia artificial que los Frowning Gapers.
Gusher
HP: 10
Cuerpos sin cabeza de los Gapers. Esto caminan sin rumbo alguno. Disparan lágrimas de sangre a cualquier dirección aleatoriamente.
Horf
HP: 10
Cabezas que flotan en la misma posición todo el tiempo. Si el jugador está en su campo de visión, ellos intentarán disparar una proyectil directamente hacia el jugador.
Clotty
HP: 15
Una gran trozo de carne que se arrastra por toda la habitación. Ocasionalmente dispara 4 proyectiles hacia arriba, abajo y los lados.
Clot
HP: 15
Un monstruo hecho de alquitrán. Al igual que Clotty, se desplaza arrastrándose y dispara 4 proyectiles, aunque Clot los dispara en todas las diagonales.
Mulligan
HP: 13
Criaturas similares a Isaac llenas de moscas. En vez de intentar atacar, ellos huye. Tampoco es capaz de hacer daño al contacto, aunque ellos pueden intentar explotar. Al morir generan 4 moscas.